【檢驗(yàn)原理】本試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)馬源性成分(Horse)保守區(qū)特異性引物結(jié)合一條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對(duì)馬源性成分(Horse)保守區(qū)的DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，從而達(dá)到快速檢測之目的。

轉(zhuǎn)基因水稻LLRICE62試劑盒(熒光-PCR法)【試劑組成】

注：

1） 不同批號(hào)試劑不能混用。

2） 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次。有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycle、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】取動(dòng)物組織及其制品、食品或飼料約 1g。

【保存和運(yùn)輸】上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃。但不能超過 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2-8℃冰袋運(yùn)輸

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

取動(dòng)物組織及其制品、食品或飼料約 1g，剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2 核酸提取

1.3 提取采用提取或試劑（磁珠法或離心柱法），請(qǐng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照；樣品每滿 10份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

5. 結(jié)果分析判定

• 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2 判斷

a) 檢測通道 Ct 值≤35，有 FAM 熒光信號(hào)檢出，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判斷樣品為陽性。

b) 當(dāng) 30<Ct 值≤35 時(shí)，且有典型的擴(kuò)增曲線時(shí)，則需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。再次擴(kuò)增后檢測體系的Ct 值仍≤35，且有典型的擴(kuò)增曲線，則判定該樣品含有相應(yīng)的動(dòng)物源性成分。當(dāng)再次擴(kuò)增后，檢測體系 Ct 值＞35，或無典型的擴(kuò)增曲線，則判定該樣品不含相應(yīng)的動(dòng)物源性成分。

6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

a) 空白對(duì)照：無FAM 熒光信號(hào)檢出或 Ct 值≥35，未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

b) 陰性對(duì)照：無FAM 熒光信號(hào)檢出或 Ct 值≥35，未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

c) 陽性對(duì)照：有 FAM 熒光信號(hào)檢出，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct 值＜30。

d) 以上應(yīng)同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無效。

轉(zhuǎn)基因水稻LLRICE62試劑盒(熒光-PCR法)【注意事項(xiàng)】

? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；檢驗(yàn)過程中，參照《GB/T 27403 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學(xué)檢測》的規(guī)定進(jìn)行。

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，混勻并短暫離心；

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

? 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全   通則》進(jìn)行處理。

.

滬崢PCR優(yōu)勢：

   1.   特異性：所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過詳盡的生物信息學(xué)分析，經(jīng)過GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，確保
所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌種屬及血清型的特異檢測。

   2.   重現(xiàn)性：該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)菌株的驗(yàn)證。

   3.   靈敏性：該系列產(chǎn)品可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測菌的高靈敏檢測，當(dāng)樣品中細(xì)菌的濃度達(dá)到103cfu/ml時(shí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)其的直接檢測，無需繁瑣的增菌過程。

   4.   實(shí)用性：檢測范圍廣，涵蓋了對(duì)人體危害較為嚴(yán)重的17種呼吸道及腸道致病菌，可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測，整個(gè)檢測過程為3-4個(gè)小時(shí)。

P CR實(shí)驗(yàn)概述